VIROLIEGIE: Exposer les mensonges de la théorie des germes et de la virologie en utilisant leurs propres sources.

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On dit qu’”une image vaut mille mots” et que “voir c’est croire”. En ce qui concerne les «virus», ces images se présentent sous la forme d’une imagerie au microscope électronique à transmission (TEM). Ce sont les représentations effrayantes des particules aux couleurs vives et améliorées numériquement que vous voyez partout dans les médias vous vendant l’idée qu’un nouveau “virus” connu sous le nom de “SARS-COV-2” existe réellement.

 

 

La particule représentative “couronne” a été partagée maintes et maintes fois, se frayant un chemin dans les t-shirts, les affiches, les jouets, les jeux vidéo, etc.

 

Comme le font souvent les meilleurs symboles, le « coronavirus » s’est profondément ancré dans la conscience collective. La plupart ne se demandent pas si les images TEM sur lesquelles ces symboles sont basés sont légitimes ni comment elles ont été réellement acquises. Les gens croient de tout cœur à l’authenticité de ces représentations de la particule enrichie qui leur ont été annoncées à plusieurs reprises sous diverses formes au cours des dernières années.

Cependant, il y a une autre citation du poète populaire Edgar Allen Poe qui dit de “croire seulement la moitié de ce que vous voyez et rien de ce que vous entendez”. En ce qui concerne les images TEM des particules prétendues être des «virus», il y a de très bonnes raisons de les mettre dans la catégorie des choses que vous voyez auxquelles vous ne devriez absolument pas croire. Pour commencer, le travail du Dr Harold Hillman , MB, BSc, MRCS, PhD ont montré que la plupart des structures et des particules observées dans l’imagerie au microscope électronique sont en fait des artefacts créés par les processus de déshydratation, d’enrobage, de fixation et de coloration des échantillons. avant d’être imagé. Comme rien ne peut survivre à ces processus, tout ce qui se trouve dans l’échantillon est dans un état mort et anormalement altéré. J’ai fourni quelques citations du Dr Hillman lui-même expliquant les problèmes de l’imagerie TEM :

‘Quel prix l’honnêteté intellectuelle ?’ demande un neurobiologiste

“J’étais tellement perturbé par l’idée que le fractionnement subcellulaire pourrait être une technique insatisfaisante que j’ai décidé de prendre une technique complètement différente et de la soumettre à une analyse plus petite. J’ai pris une microscopie électronique, en posant la question : « Qu’est-ce qu’une photo prise avec cet instrument en dit sur la structure de la cellule vivante ? » Depuis le début des années 1950, il y a eu une passion pour relier la «structure» à la «fonction», c’est-à-dire l’apparition par microscopie électronique d’une partie identifiable particulière d’une cellule avec la biochimie qu’elle présente.

Le microscope optique a été utilisé pour examiner des cellules vivantes, des tissus non fixés et des coupes colorées, pendant 100 ans jusqu’aux années 1940. A cette époque, le microscope électronique a été introduit. Il permet une résolution et un grossissement beaucoup plus élevés que le microscope optique, mais le tissu ne peut pas survivre à la basse pression, au bombardement d’électrons et aux rayons X dans le microscope électronique, il doit donc être recouvert d’un dépôt de sels de plomb d’osmium ou le tungstène, qui n’est pas détruit par ces agents, et peut donc être examiné. Les cytologistes étaient très impatients d’utiliser cet instrument plus puissant pour examiner la structure fine des cellules.

“Par exemple, la plupart des cytologistes savent, mais pas les lecteurs de manuels élémentaires, que lorsqu’on regarde une illustration d’une micrographie électronique : un animal a été tué ; ça refroidit; son tissu est excisé ; le tissu est fixé (tué); il est coloré avec un sel de métal lourd ; il se déshydrate avec des concentrations croissantes d’alcool ; ça rétrécit; l’alcool est extrait avec un solvant gras, l’oxyde de propylène ; cette dernière est remplacée par une résine époxy ; il durcit en quelques jours ; des sections d’un dixième de millimètre d’épaisseur ou moins sont coupées ; on les place dans le microscope électronique dont presque tout l’air est pompé ; un faisceau d’électrons de 10 000 volts à 3 000 000 volts est dirigé vers lui ; certains électrons viennent frapper un écran phosphorescent ; les microscopistes électroniques sélectionnent le champ et le grossissement qui montrent les caractéristiques qu’ils souhaitent mettre en évidence ; l’image peut être rehaussée ; des photographies sont prises; On peut immédiatement voir à quel point le tissu a voyagé de la vie à une illustration dans un livre.

“J’ai montré, à ma propre satisfaction, que (i) au moins certaines techniques de recherche biochimiques importantes et populaires n’ont jamais été contrôlées, (ii) la plupart des nouvelles structures dans les cellules apparentes par microscopie électronique sont des artefacts, (iii) il n’y a que des nerfs. cellules et noyaux nus dans une substance fondamentale dans le cerveau et la moelle épinière, (iv) il n’y a pas de synapses, (v) l’hypothèse du transmetteur est douteuse. J’ai publié toutes les preuves de ces déclarations, même si cela n’a pas toujours été facile.

https://www.big-lies.org/harold-hillman-biology/what-price-intellectual-honesty.htm

Dr Harold Hillman

 

Le Dr Hillman a produit et publié des preuves montrant que les processus utilisés pour créer toute image TEM modifient de manière significative les propriétés des tissus ou des échantillons qui leur sont soumis. Il a montré que les structures et les particules vues sont des artefacts et que les études produisant ces images manquent des contrôles nécessaires et appropriés qui prouveraient que ses affirmations sont correctes. Les brefs paragraphes ci-dessus du Dr Hillman ne rendent pas justice à son travail car les preuves qu’il a découvertes ont largement contribué à remettre en question le dogme scientifique accepté selon lequel les images TEM sont une preuve valide de quoi que ce soit. Même si l’on devait ignorer le travail du Dr Hillman et croire toujours que les particules choisies parmi une mer de milliards de particules similaires et identiques représentent en fait des « virus », il y a une autre raison très frappante de réexaminer cette position.

Crise d’identité

Alors que l’engouement pour le “coronavirus” battait son plein au début de 2020, de nombreuses études sont apparues prétendant montrer des images TEM de particules “SARS-COV-2” dans différents tissus et organes en dehors des poumons. Ces études ont été utilisées pour justifier les affirmations selon lesquelles le «virus» attaquait divers organes tels que les reins. Les virologues et la propagande des médias grand public ont affirmé que ces images étaient la preuve du «virus» et que le «SRAS-COV-2» pouvait se propager dans tout le corps. Cependant, d’autres chercheurs ont commencé à remettre en question la validité des images de ces études, affirmant que les particules représentées n’étaient pas “SARS-COV-2”, mais étaient en fait d’autres vésicules subcellulaires. Ces chercheurs savaient ce que la plupart des gens ne savent pas, c’est-à-dire que les particules dites “virus” ne peuvent pas être distinguées des particules subcellulaires “non virales” normales comme les vésicules enrobées ubiquitaires, telles que les vésicules enrobées de clathrine, ou les vésicules enrobées de COPI ou COPII, ainsi que les corps multivésiculaires (MVB) et exosomes. Même le revêtement en forme de couronne supposément spécifique au «virus» CORONA (alias couronne) peut être vu sur ces particules «non virales». Ainsi, de nombreuses images TEM du “SARS-COV-2” ont été à juste titre contestées.

En juillet 2020, un groupe de chercheurs s’est penché sur ce débat et a mené ses propres expériences pour voir si oui ou non les particules dites « SARS-COV-2 » pouvaient être choisies parmi les nombreuses similaires et identiques dans le Images TEM. Pour ce faire, ils ont prélevé des échantillons dans les poumons et les reins de quatre patients “Covid-19”. Ils ont utilisé la RT-PCR pour déterminer qu’il y avait de l’ARN “viral” dans les poumons mais pas dans les reins. Lors d’un examen ultrastructural, les chercheurs ont trouvé des particules “de type coronavirus” dans les échantillons de poumon avec de l’ARN “viral”. Cependant, ils en ont également trouvé des identiques dans les échantillons de rein sans ARN «viral». Les chercheurs ont même trouvé exactement les mêmes particules « de type corona » dans des échantillons de 2 patients sans « SRAS-COV-2 » qui ont été prélevés avant la « pandémie ».

Virions du SRAS-CoV-2 ou structures cellulaires omniprésentes ? Dilemme réel à l’ère du COVID-19

“Plusieurs rapports ont suggéré des preuves ultrastructurales d’infection directe de différents types de cellules rénales par le coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2) dans des analyses post-mortem et des échantillons de biopsie rénale chez des patients atteints d’une réaction en chaîne par polymérase virale à transcriptase inverse prouvée (RT -PCR) à partir de frottis nasopharyngés. La détection de particules virales supposées par microscopie électronique à transmission (TEM) a été utilisée comme preuve suffisante de l’invasion virale du tissu rénal, mais les données concernant la détection de l’ARN viral ou d’autres méthodes précieuses pour la détection virale des échantillons de rein manquaient. De même, une étude supplémentaire a proposé une infection directe par le SRAS-CoV-2 des cellules endothéliales dans plusieurs organes de patients atteints de la maladie à coronavirus 2019 (COVID-19) sur la base du TEM uniquement. Les particules présentées dans les études susmentionnées présentent un diamètre de 50 à 150 nm et un revêtement dense aux électrons en forme de couronne, de sorte qu’elles peuvent ressembler au coronavirus mais également à des vésicules revêtues omniprésentes, telles que des vésicules recouvertes de clathrine, ou COPI- ou Vésicules recouvertes de COPII. De plus, les grappes de particules virales à l’intérieur de la vacuole pourraient ressembler à des corps multivésiculaires (MVB), qui sont des structures régulières de la voie endocytaire.

Ici, pour détecter l’invasion directe du SRAS-CoV-2 dans le rein, nous avons effectué une RT-PCR sur des échantillons frais de poumon et de rein post-mortem de 4 patients atteints de COVID-19. Chez les 4 patients, l’ARN viral a été confirmé dans tous les échantillons de poumon, mais était négatif dans tous les échantillons de rein. Cependant, l’examen ultrastructural a révélé des structures vésiculaires intracellulaires de taille et de morphologie similaires dans les poumons avec de l’ARN viral prouvé et dans les reins sans ARN viral. Dans des échantillons de poumon avec de l’ARN viral éprouvé, nous avons observé de nombreuses structures qui pourraient être soit des particules virales avec une couronne typique, soit des vésicules recouvertes d’une couche de protéine dense aux électrons ( Figure 1 a). De plus, dans les mêmes échantillons pulmonaires positifs pour le SRAS-CoV-2,nous avons trouvé des vacuoles qui pourraient être soit des amas de particules virales liés à la membrane, soit des MVB avec des vésicules intraluminales à l’intérieur ( Figure 1 c). D’autre part, l’examen ultrastructural des échantillons pulmonaires de 2 patients sans SRAS-CoV-2 (1 échantillon d’autopsie de poumon avec RT-PCR négatif pour l’ARN viral et 1 échantillon de biopsie de poumon avant l’ère COVID) a révélé les mêmes structures, ressemblant à particules virales, vésicules enrobées ou MVB, comme dans un échantillon avec SARS-CoV-2 positif ( Figure 1 b et d).

L’analyse TEM d’échantillons rénaux post-mortem de patients atteints de COVID-19 a révélé de nombreuses vésicules individuelles et grappes de vésicules dans différents types de cellules rénales, malgré une RT-PCR négative pour l’ARN du SRAS-CoV-2 ( Figure 1 e et f). Nous avons en outre effectué une analyse semi-quantitative de ces structures intracellulaires dans différents types de cellules rénales à partir de 20 biopsies rénales de donneurs préimplantatoires, avant et pendant l’épidémie de SRAS-CoV-2, avec une RT-PCR négative pour l’ARN du SRAS-CoV-2 afin de démontrer que ces les structures cellulaires sont nombreuses et omniprésentes dans divers types de cellules ( tableau 1 ).

De plus en plus de preuves indiquent que les vésicules enrobées et les MVB peuvent imiter les particules virales. Cependant, on sait que le bourgeonnement des virus enveloppés (auquel appartient le SRAS-CoV-2) à partir de la membrane plasmique, ou de la membrane limitante de l’endosome, ressemble à la formation de vésicules intraluminales à l’intérieur des MVB. De plus, les 2 processus partagent certains composants de la même machinerie protéique. En effet, nous avons détecté des vésicules intraluminales bourgeonnant à partir de la membrane limitante discontinue de la vacuole dans les cellules endothéliales pulmonaires avec un ARN SARS-CoV-2 positif ( Figure 1 a). Cette découverte suggère fortement que cette structure n’est pas des MVB mais plutôt un amas de particules virales avec des virions en herbe. La preuve indiscutable des virions ne serait donc apportée que par la microscopie immunoélectronique.En outre, les vésicules enrobées peuvent également ressembler légèrement à des particules virales, mais il est nécessaire d’être prudent quant à l’emplacement intracellulaire des vésicules enrobées. Plus précisément, les vésicules enrobées sont transitoires et se trouvent donc principalement à proximité immédiate de la membrane à partir de laquelle elles bourgeonnent, car elles perdent leur enveloppe quelques secondes après leur formation.

Pour conclure, bien que le TEM puisse servir de méthode de diagnostic utile pour la détection d’une infection virale, il convient d’être prudent lorsque la confirmation de l’invasion virale repose uniquement sur le TEM. Des méthodes convaincantes supplémentaires, y compris la microscopie immunoélectronique, l’immunohistochimie et l’analyse du matériel génétique viral, sont nécessaires pour une preuve indiscutable de l’invasion virale dans les organes.

https://www.kireports.org/article/S2468-0249(20)31368-1/fulltext

Crise d’identité?

Que les particules revendiquées comme “SARS-COV-2” aient été trouvées non seulement dans des échantillons sans ARN “viral” mais aussi dans des échantillons de patients sans “SARS-COV-2” de l’ère pré-“Covid-19” devrait suffire pour quiconque étant intellectuellement honnête de conclure que les particules dans les images TEM ne sont rien d’autre qu’une représentation dénuée de sens. Il est admis que les mêmes particules « SARS-COV-2 » peuvent être des corps micro vésiculaires, des vésicules recouvertes de clathrine, un appareil de Golgi, des granules et vésicules sécrétoires, des vésicules recouvertes de coatomères et/ou des exosomes. Alors que les images peuvent être n’importe quoi aux yeux du spectateur, ce qu’elles ne peuvent pas être, c’est une preuve valable de «virus».

Un peu plus d’un an plus tard, en septembre 2021, les mêmes chercheurs ont publié une autre étude au sujet de la mauvaise interprétation des images TEM. Cette fois, alors qu’ils reconnaissaient toujours que l’utilisation de la TEM pour identifier les « virus » pouvait être trompeuse et ne convenait pas à elle seule comme preuve, ils visaient à corriger ce problème en utilisant leur propre méthode qui était une variante de la microscopie corrélative qui combinait le marquage immunohistochimique avec la TEM. Essentiellement, les chercheurs ont utilisé des anticorps théoriques pour tenter de prouver des «virus» théoriques en affirmant que les anticorps ciblaient et marquaient les particules qui étaient «SARS-COV-2». Dans cette approche, les chercheurs affirment qu’ils pourraient distinguer les particules qui sont “SARS-COV-2” de celles qui ne sont pas “SARS-COV-2″… même si les particules sont identiques à tous les autres égards.

Il y a beaucoup de problèmes avec cette théorie et finalement leurs preuves. Tout d’abord, comme les anticorps n’ont jamais été correctement purifiés ni isolés eux-mêmes, on ne peut pas utiliser une création fictive pour valider une autre création fictive. Même si l’existence d’anticorps avait été scientifiquement prouvée, sans avoir purifié et isolé les particules prétendues être “SARS-COV-2”, il ne peut y avoir aucun moyen de savoir quels anticorps théoriques seraient spécifiques au “virus” lui-même. Il a été démontré à plusieurs reprises que les anticorps sont non spécifiques et peuvent se lier à de nombreuses autres protéines autres que la cible visée. Les études reposant sur des anticorps sont rarement reproduites , ce qui a conduit à une crise de reproductibilité entraînant des résultats faux et erronés constituant la majorité de la recherche scientifique.

Les chercheurs ont également fourni de nombreuses autres raisons dans leur propre article expliquant pourquoi les méthodes qu’ils ont utilisées comme « preuve » ne sont pas fiables. Il a été déclaré que :

  1. L’immunohistochimie peut être faussement positive ou négative pour plusieurs raisons dans la phase pré-analytique ou analytique.
  2. Les antigènes sont connus pour être vulnérables à plusieurs étapes de la procédure immunohistochimique et également lors de la préparation des échantillons pour TEM.
  3. L’analyse TEM conventionnelle dépend fortement de la préservation des tissus, ce qui pourrait déformer la structure des «virus» si elle n’est pas effectuée de manière optimale.
  4. L’échantillon utilisé pour l’analyse TEM peut manquer la zone contenant des “virus”.
  5. Une réaction IHC au niveau de la microscopie optique pourrait être trompeuse en raison d’une mauvaise interprétation de la coloration non spécifique.
  6. Le faible grossissement et la faible résolution de l’IHC ne permettent pas aux pathologistes de voir des “virions” ou d’être convaincus qu’une réaction IHC colocalise avec des “virions”.
  7. Malgré la possibilité de voir les structures (“virions”) avec TEM en raison de sa haute résolution, elles peuvent être mal interprétées.
  8. Afin d’obtenir une immunoréaction “spécifique” et “fiable”, cela dépend essentiellement du protocole d’immunomarquage, des premières étapes de préparation de l’échantillon de tissu au choix de l’anticorps.

L’article lui-même décrit en détail ce qui est réellement fait pour préparer les échantillons à la fois pour l’immunohistochimie et l’imagerie TEM. J’ai mis en évidence ces sections pour mettre en valeur les nombreux processus et substances auxquels l’échantillon est soumis pour l’imagerie. Comme l’a souligné le Dr Hillman, les images du résultat final après les multiples modifications apportées à l’échantillon peuvent difficilement être considérées comme une représentation précise de ce qui a été prélevé à l’intérieur d’un être vivant.

En fin de compte, les chercheurs ont découvert que des milieux de fixation et d’enrobage appropriés sont essentiels pour obtenir les résultats souhaités, car cela peut restreindre à la fois l’accès aux anticorps et la qualité des anticorps. Les résultats du marquage immunogold du “SARS-CoV-2” dépendaient fortement de la sélection de l’anticorps primaire et de la résine car ils n’ont pu obtenir une coloration “spécifique” et une ultrastructure satisfaisante que sur des coupes Lowicryl avec un anticorps “approprié” . Les chercheurs ont essayé diverses autres méthodes en utilisant d’autres anticorps «spécifiques au SRAS-COV-2» avec des sections Epon ultrafines qui n’ont toutes pas produit les résultats qu’ils voulaient voir. Curieusement, contrairement à leur rapport précédent qui avait en fait un contrôle des patients « SARS-COV-2 » négatifs qui montraient que les mêmes particules se trouvaient chez ceux qui n’étaient pas atteints de la maladie,

Vous trouverez ci-dessous l’article complet de ce qu’ils prétendent être la preuve indiscutable que le « SRAS-COV-2 » a été trouvé dans les tissus infectés. Sur la base de la longue liste de problèmes mentionnés ci-dessus, ce n’était évidemment pas le cas :

Il ne suffit pas de voir pour croire : l’immunomarquage comme
preuve indiscutable des virions du SRAS-CoV-2 dans les tissus infectés

« Il y a de plus en plus de preuves que l’identification des virions du SRAS-CoV-2 par microscopie électronique à transmission pourrait être trompeuse en raison de la morphologie similaire des virions et des structures cellulaires omniprésentes. Cette étude visait ainsi à établir des méthodes de preuve indiscutable de la présence de virions du SRAS-CoV-2 dans le tissu observé. Méthodes : Nous avons développé une variante de l’approche de microscopie corrélative pour l’identification des protéines du SRAS-CoV-2 en utilisant le marquage immunohistochimique des protéines du SRAS-CoV-2 aux niveaux de la microscopie optique et électronique. Nous avons également effectué un marquage immunogold des virions du SRAS-CoV-2. Résultats : L’immunohistochimie (IHC) des protéines de la nucléocapside du SRAS-CoV-2 et la microscopie corrélative ultérieure ont sans aucun doute prouvé la présence de
Virions du SRAS-CoV-2 dans le tissu nasopharyngé humain analysé. La présence des virions SARS-CoV-2 a été également confirmée par l’étiquetage d’immunogold pour la première fois. Conclusions : La microscopie immunoélectronique
est la méthode la plus fiable pour distinguer les particules virales intracellulaires des structures cellulaires normales de morphologie et de taille similaires à celles des virions. De plus, nous avons développé une variante de la microscopie corrélative qui permet aux pathologistes de vérifier les résultats de l’IHC effectuée d’abord sur des échantillons inclus en paraffine couramment utilisés, suivis de coupes semi-minces et enfin de coupes ultra-minces. Les deux approches méthodologiques ont incontestablement prouvé la présence de virions du SRAS-CoV-2 dans les cellules.

1. Introduction

Depuis l’émergence du SARS-CoV-2, de nombreuses études ont rapporté des virions présumés du SARS-CoV-2 dans les tissus des patients COVID-19 trouvés par microscopie électronique à transmission (TEM) [1–3]. La détection de particules virales par TEM uniquement a été utilisée comme preuve suffisante pour l’identification virale dans les études susmentionnées, indiquant la preuve d’une infection virale directe de certaines cellules et tissus. Cependant, peu d’auteurs ont attiré l’attention sur la possible mauvaise interprétation de ces résultats en raison de la similitude de structure et de taille entre les virions et les structures cellulaires normales [4,5]. Dans une étude précédente, nous avons montré des structures cellulaires ressemblant à des virions du SRAS-CoV-2 dans des échantillons pulmonaires et rénaux de patients positifs et négatifs pour le SRAS-CoV-2 sur la base de leurs résultats de RT-PCR pour l’ARN du SRAS-CoV-2 [6].À la lumière de nos résultats, nous avons donc suggéré que pour une identification sans ambiguïté des virions dans les cellules et les tissus, des méthodes telles que l’immunohistochimie ou la microscopie immunoélectronique sont nécessaires, en plus de l’analyse du matériel génétique viral.

Les méthodes existantes utilisées pour la détection virale dans des échantillons de tissus ont des limites connues. Par exemple, l’immunohistochimie peut être faussement positive ou négative pour plusieurs raisons dans la phase pré-analytique ou analytique. De plus, l’analyse TEM conventionnelle dépend fortement de la préservation des tissus, ce qui pourrait déformer la structure des virus s’il n’est pas effectué de manière optimale. Un inconvénient supplémentaire de l’analyse TEM est que l’échantillon peut manquer la zone contenant des virus [7]. D’autre part, la microscopie immunoélectronique est une méthode très puissante et hautement sophistiquée pour la détection et l’identification des virus, mais elle est principalement disponible dans les milieux universitaires. La méthode qui relie les méthodes susmentionnées et représente également un pont entre la lumière et
la microscopie électronique est une microscopie corrélative.

Nous avons effectué une variante de l’immunohistochimie corrélative et du marquage immunogold des protéines du SRAS-CoV-2 pour une preuve indiscutable de la présence de virions du SRAS-CoV-2 dans le tissu nasopharyngé des patients avec une RT-PCR positive pour l’ARN du SRAS-CoV-2. Nous avons combiné le marquage immunohistochimique des protéines du SRAS-CoV-2 aux niveaux de la microscopie optique et électronique et avons ainsi développé une approche de microscopie corrélative pour l’
identification des protéines du SRAS-CoV-2, pour laquelle il n’existe à ce jour aucun rapport dans la littérature.Nous avons également montré qu’une immunoréaction spécifique et fiable dépend de manière cruciale du protocole d’immunomarquage, des premières étapes de préparation des échantillons de tissus au choix de l’anticorps. Nous pensons que l’immunomarquage, s’il est effectué correctement, est la méthode la plus fiable pour distinguer les particules virales intracellulaires des structures cellulaires normales de structure et de taille similaires aux virions. À notre connaissance, il s’agit du premier rapport sur l’immunomarquage des virions du SRAS-CoV-2 au niveau de la microscopie électronique.

2. Matériels et méthodes

2.1. Patients

Des échantillons d’autopsie de tissu nasopharyngé de patients positifs pour le SRAS-CoV-2 par RT-PCR ont été prélevés pour l’immunohistochimie et le marquage immunogold des virions du SRAS-CoV-2.

2.2. Immunohistochimie (IHC) pour la microscopie électronique corrélative et à transmission (TEM)

Des morceaux de tissu nasopharyngé (5 mm3) ont été fixés dans du paraformaldéhyde à 4 % (Merck, Darmstadt, Allemagne) pendant 24 h, déshydratés dans de l’éthanol et inclus dans de la paraffine. L’échantillon de tissu pour l’immunohistochimie a été obtenu en poinçonnant le bloc de paraffine avec un poinçon de tissu manuel. Les blocs de paraffine poinçonnés ont ensuite été déparaffinés et réhydratés avec de l’éthanol. La récupération de l’antigène a été effectuée avec un chauffage par micro-ondes dans un tampon de citrate de sodium 10 mM, pH 6, 0 (Sigma Aldrich, Burlington, MA, USA) pendant 20 min. Les peroxydases endogènes ont été bloquées par du peroxyde d’hydrogène à 3% (Ventana, Monterey, CA, USA) pendant 15 min après incubation dans des anticorps primaires de lapin contre la protéine de nucléocapside du SRAS-CoV-2 (1:600 ; NB100, Novus Biologicals, Cambridge, Royaume-Uni) pendant 2 h à température ambiante. Après lavage avec un tampon de réaction (Ventana, Monterey, CA, USA), un kit de détection UltraView Universal DAB (Ventana, Monterey, CA, USA) a été utilisé avec le protocole suivant : enzyme HRP conjuguée à des anticorps secondaires anti-lapin de chèvre pendant 20 min , tampon de réaction (Ventana, Monterey, CA, USA) deux fois pendant 5 min, un mélange de chromogène 3,3′-diaminobenzidine
(DAB) et H2O2 pendant 20 min, et enfin lavé avec un tampon de réaction (Ventana, Monterey, CA, USA ) et de l’eau distillée pendant 5 min.

Après l’IHC, les échantillons de tissus ont été transférés dans un tampon phosphate de Millonig 0,1 M pendant la nuit et traités le lendemain pour la microscopie électronique à transmission. Ils ont d’abord été post-fixés dans 1% d’OsO4 (Merck, Darmstadt, Allemagne) pendant 30 min, puis déshydratés dans des concentrations graduées d’éthanol et d’oxyde de propylène 1-2-oxyde de propylène (Merck, Darmstadt, Allemagne) pendant 10 min dans chaque solution . Les morceaux de tissu ont ensuite été incubés dans un mélange (1:1) d’oxyde de 1-2-propylène et de résine Epon 812 (Serva Electrophoresis, Heidelberg, Allemagne) pendant 20 min, inclus dans 100% Epon et polymérisés à 60 ◦C pendant 24 h. Le lendemain, coupes semi-fines de 1 µmont été coupés avec un ultramicrotome Leica EM UC6 et colorés avec une solution de coloration Azure II pour trouver des cellules SARS-CoV-2-positives comme région d’intérêt, afin de sélectionner cette région pour une coupe ultra-mince. Des coupes ultrafines de 60 nm ont été coupées et visualisées dans un microscope électronique à transmission JEM-1200 EXII (JEOL, Tokyo, Japon) à 60 kV (Figure 1).

2.3. Marquage Immunogold sur coupes ultrafines

Pour le marquage immunogold sur des coupes Epon ultrafines, de petits échantillons (2 mm3) de tissu nasopharyngé ont été fixés dans un mélange de 4 % de paraformaldéhyde (Merck, Darmstadt, Allemagne) et 2 % de glutaraldéhyde (Serva, Heidelberg, Allemagne) dans un tampon cacodylate 0,2 M ( pH 7,3) pendant 3 h à 4 ◦C. Un rinçage nocturne dans du saccharose 0,33 M dans un tampon cacodylate 0,2 M a été suivi d’une post-fixation avec 1% d’OsO4 (Serva, Heidelberg, Allemagne) pendant 1 h. Après
déshydratation dans une série d’éthanol, des échantillons de tissus ont été inclus dans de la résine Epon 812 (Serva Electrophoresis, Heidelberg, Allemagne) et coupés en sections ultrafines (60 nm d’épaisseur), qui ont été collectées sur des grilles de nickel. Le traitement de démasquage antigénique a été réalisé par incubation de certaines grilles en chambre humide sur une grosse goutte d’une solution aqueuse saturée de métapériodate de sodium (Merck, Darmstadt, Allemagne) pendant 1 h à température ambiante. Les grilles sont ensuite lavées à l’eau distillée. Le marquage non spécifique a été bloqué par un tampon de blocage (5 % de sérum de veau fœtal dans 0,1 % de BSA dans du PBS (tampon de lavage)) pendant 30 min à température ambiante. Des anticorps primaires contre la protéine de nucléocapside du SRAS-CoV-2 (NB100 ; Novus Biologicals, Cambridge, Royaume-Uni) dilués au 1/50 ou la glycoprotéine de pointe du SRAS-CoV-2 S1 (ab 275759 ; Abcam, Cambridge, Royaume-Uni) dilués au 1 : 100 ont été appliqués et incubé une nuit à 4 ◦C. Après lavage dans un tampon de lavage, des anticorps secondaires de chèvre anti-lapin avec 18 nm d’or (Au) dilué au 1:40 dans du tampon de blocage ont été appliqués pendant 90 min. Dans tous les cas, les fabricants des anticorps utilisés ont apporté la preuve de la validation des spécifications techniques. Dans tous les cas, des contrôles négatifs ont également été effectués, dans lesquels les anticorps primaires ont été remplacés par du PBS. Les coupes ont été contre-colorées avec de l’acétate d’uranyle et du citrate de plomb.

Pour le marquage immunogold sur des coupes Lowicryl ultrafines, de petits cubes (1 mm 3) de tissu nasopharyngé ont été transférés dans du paraformaldéhyde à 2 % (Merck, Darmstadt Allemagne) plus du glutaraldéhyde à 0,05 % (Serva, Heidelberg, Allemagne) dans du PBS pendant 1 h à température ambiante. Les échantillons ont été déshydratés en abaissant progressivement la température, puis
enrobés dans de la résine Lowicryl HM20 (Polysciences, Eppelheim, Allemagne) dans un appareil Leica AFS (Leica Microsystems, Vienne, Autriche), selon le protocole suivant : 30 % d’éthanol pendant 30 min à 0 ◦C, 55 % d’éthanol pendant 30 min à −15 ◦C, 70 % d’éthanol pendant 30 min à −30 ◦C, 100 % d’éthanol pendant 1 h à −50 ◦C, 75 % éthanol/25 % HM20 pendant 1 h à −50 ◦C, 50 % éthanol/50 % HM20 pendant 1 h à −50 ◦C, 25 % éthanol/75 % HM20 pendant 1 h à -50 ◦C, 100 % HM20 pendant 1 h et 100 % HM20 pendant la nuit à -50 ◦C. HM20 a été polymérisé pendant 48 h à -50 ◦C puis pendant 24 h à -20 ◦C sous lumière UV. Des coupes ultrafines (60 nm d’épaisseur) ont été découpées et collectées sur des grilles de nickel. Les sections ont été lavées dans un tampon de lavage (0,1 % d’azide de Na, 0,8 % de BSA et 0,1 % de gélatine IGSS dans du PBS), bloquées dans un tampon de blocage (5 % de sérum de veau fœtal dans 0,1 % de BSA dans du PBS (tampon de lavage)) pendant 30 min à température ambiante et incubé une nuit à 4 ◦C avec des anticorps primaires contre la protéine de nucléocapside du SRAS-CoV-2 (NB100-56576 ; Novus Biologicals, Cambridge, Royaume-Uni) diluée à 1:50 ou la glycoprotéine de pointe du SRAS-CoV-2 S1 (ab 275759 ; Abcam, Cambridge, Royaume-Uni) dilué 1:100. Après lavage dans un tampon de lavage, des anticorps secondaires de chèvre anti-lapin avec 18 nm d’or (Au) dilué au 1:40 dans du tampon de blocage ont été appliqués pendant 90 min. Les coupes ont été contre-colorées avec de l’acétate d’uranyle et du citrate de plomb. Des sections ultrafines ont été observées dans un microscope électronique à transmission Philips CM100 (Philips, Amsterdam, Pays-Bas) à 80 kV (Figure 1).

3. Résultats

3.1. Approche de microscopie corrélative et détection du virion du SRAS-CoV-2

Les résultats de l’immunohistochimie des protéines de la nucléocapside du SRAS-CoV-2 et de la microscopie corrélative ultérieure ont sans aucun doute prouvé la présence de virions du SRAS-CoV-2 dans le tissu nasopharyngé humain analysé (Figure 2). Nous avons détecté des cellules avec une
coloration immunohistochimique positive dans des sections semi-minces par microscopie optique (figure 2a). Les mêmes cellules avec une coloration immunohistochimique positive ont été examinées sur des sections Epon ultrafines, montrant un matériau dense aux électrons dans le cytoplasme à l’intérieur des endosomes (Figure 2b, c). Enfin, à un grossissement plus élevé, nous avons identifié dans les endosomes des virions cellulaires observés marqués par une fine réaction granulaire dense aux électrons correspondant au produit de DAB (Figure 2d).

3.2. Approche par microscopie immunoélectronique et détection du virion SARS-CoV-2

Grâce au marquage immunogold, nous avons confirmé la présence de virions du SRAS-CoV-2 dans des échantillons de tissus nasopharyngés humains. Les résultats de cette méthode dépendaient grandement du type de coupes ultrafines et des anticorps primaires utilisés dans le protocole d’immunomarquage (Figure 3). La réaction d’Immunogold sur des coupes Epon ultrafines avec des anticorps primaires contre la protéine de nucléocapside du SARS-CoV-2 (Novus Biologicals) était omniprésente et donc non spécifique (Figure 3a), tandis que sur des coupes Epon ultrafines avec des anticorps primaires contre la glycoprotéine de pointe SARS-CoV-2 S1 (Abcam ), il était rare et non spécifique ( Figure 3b). Après une procédure de démasquage d’antigène sur des coupes ultrafines d’Epon (décrite dans Méthodes) avec des anticorps primaires contre la glycoprotéine de pointe SARS-CoV-2 S1 (Abcam),le marquage immunogold était plus spécifique mais faible (Figure 3c). Le marquage immunogold sur des coupes Lowicryl ultrafines avec des anticorps primaires contre la glycoprotéine de pointe SARS-CoV-2 S1 (Abcam) était spécifique et intense (Figure 3d).

 

 

4. Discussion

L’analyse du matériel génétique viral du tissu nasopharyngé des patients n’est pas en soi une preuve suffisante de l’infection active par le SRAS-CoV-2 dans les tissus corporels, mais un test RT-PCR positif, qui est actuellement un test établi pour l’infection par le SRAS-CoV-2, est une condition préalable à une analyse plus approfondie de la présence du virus SARS-CoV-2 dans un tissu particulier. De même, l’analyse TEM en soi n’est pas suffisante pour une preuve sans équivoque des virions du SRAS-CoV-2 dans le tissu d’intérêt en raison de la structure et de la taille similaires de ces virions et des structures cellulaires omniprésentes [4,5]. Ainsi, nous avons souligné dans une étude précédente qu’après un test RT-PCR positif pour l’ARN du SRAS-CoV-2, l’IHC ou même la microscopie immunoélectronique est nécessaire pour l’identification fiable des virions dans les tissus infectés suspects.

Dans cette étude, nous présentons deux approches d’immunomarquage sur des échantillons de tissus nasopharyngés d’autopsie de patients avec une RT-PCR positive pour l’ARN du SRAS-CoV-2. Nous avons donc réalisé une microscopie corrélative dans laquelle nous avons combiné les avantages de l’IHC et de la microscopie électronique pour analyser le même échantillon. Nous avons d’abord effectué une réaction immunohistochimique contre la protéine de nucléocapside du SRAS-CoV-2 avec le chromogène diaminobenzidine (DAB) sur des coupes de paraffine, qui est une méthode de diagnostic standard dans notre laboratoire de pathologie. Le DAB est oxydé en présence de peroxydase et de peroxyde d’hydrogène, puis fixé sur des anticorps secondaires, entraînant le dépôt d’un précipité de couleur brune au site d’activité enzymatique, visible en microscopie optique et également en microscopie électronique, notamment après post-fixation avec de l’osmium [8]. Nous avons également effectué le même protocole immunohistochimique sur de petits morceaux de tissu déparaffinés qui ont ensuite été fixés dans de l’osmium, inclus dans de la résine Epon et coupés en sections semi-fines. Enfin, la zone sélectionnée de cellules avec une coloration immunohistochimique positive a été coupée pour TEM. La réaction immunohistochimique a permis la visualisation des virions du SRAS-CoV-2 marqués par immunohistochimie dans les cellules infectées sur une coupe semi-mince par microscopie optique, suivie de la détection TEM des virions du SRAS-CoV-2 dans la même cellule sur des coupes ultra-minces. Nous avons réussi à préserver le marquage immunohistochimique des virions avec DAB pendant la procédure d’enrobage TEM et avons montré que l’IHC et le TEM peuvent être utilisés comme méthodes analytiques pour l’identification sans ambiguïté des virions du SRAS-CoV-2.

L’immunohistochimie est une méthode complémentaire courante en pathologie à des fins diagnostiques, mais toutes les étapes de cette technique doivent être optimisées. Les antigènes sont connus pour être vulnérables à plusieurs étapes de la procédure immunohistochimique et également lors de la préparation des échantillons pour TEM [9,10]. En sélectionnant soigneusement les protocoles pour la procédure IHC et TEM et en effectuant toutes les procédures avec précision, nous avons conservé une bonne accessibilité des épitopes et également obtenu une réaction hautement spécifique au niveau de la microscopie électronique.

De notre point de vue, la microscopie immunoélectronique est la méthode la plus fiable pour distinguer les particules virales intracellulaires des structures cellulaires normales de morphologie et de taille similaires à celles des virions. Malheureusement, un équipement spécial et coûteux est nécessaire pour cette méthodologie. Par conséquent, nous avons développé une variante de microscopie corrélative qui permet à chaque laboratoire de pathologie de routine de vérifier ses résultats d’IHC effectués sur des échantillons inclus en paraffine utilisés en routine, ainsi qu’avec un microscope électronique à transmission sans instruments hautement développés et techniques sophistiquées. A savoir, une réaction IHC au niveau de la microscopie optique en soi pourrait être trompeuse en raison de divers facteurs dans la phase pré-analytique et d’une mauvaise interprétation de la coloration non spécifique. De plus, le faible grossissement et la résolution de l’IHC ne permettent pas aux pathologistes de voir les virions ou d’être convaincus qu’une réaction IHC colocalise avec les virions. De même, l’analyse TEM conventionnelle en soi n’est pas non plus suffisante pour une preuve incontestable des virions présents. A savoir, malgré la possibilité de voir les structures (virions) avec TEM en raison de sa haute résolution, nous pouvons mal les interpréter. Ainsi, seule la combinaison de la localisation d’une immunoréaction positive sur le structure d’intérêt (c’est-à-dire des virus) et l’identification simultanée de cette structure au niveau ultrastructural donne une preuve indiscutable de la présence de virions. Nous pourrions donc recommander aux pathologistes des laboratoires de pathologie de routine de confirmer leurs résultats d’IHC contre le virus SARS-CoV-2 avec la microscopie corrélative décrite dans notre manuscrit. À notre avis, c’est la principale production scientifique de nos travaux qui peut être transférée dans la pratique quotidienne. Nous sommes conscients qu’il représente une petite pièce du puzzle SARS-CoV-2 ; cependant, chaque élément est important pour rendre l’image plus claire. De nos jours, nous ne pouvons pas nous permettre des rapports de pathologie faussement positifs ou faux négatifs, surtout si nous avons les connaissances et la méthodologie appropriées.

Afin d’éviter les pièges du marquage immunogold, des milieux de fixation et d’enrobage appropriés, qui peuvent restreindre à la fois l’accès aux anticorps et la qualité des anticorps, sont cruciaux [11,12]. Dans notre étude, les résultats du marquage immunogold des virions du SRAS-CoV-2 dépendaient fortement de la sélection de l’anticorps primaire et de la résine. Ce n’est que sur des coupes Lowicryl et avec un anticorps approprié que nous avons pu obtenir une coloration spécifique et une ultrastructure satisfaisante. Le marquage immunogold des coronavirus a été rapporté [13], mais nous pensons qu’il s’agit du premier rapport à ce jour sur l’identification des virions du SRAS-CoV-2 par microscopie immunoélectronique.

5. Conclusions

Pour conclure, la microscopie immunoélectronique, si elle est effectuée correctement, est la méthode la plus fiable pour distinguer les particules virales intracellulaires des structures cellulaires normales de morphologie et de taille similaires à celles des virions. De plus, nous avons développé une variante de la microscopie corrélative qui permet aux pathologistes de vérifier les résultats de l’IHC effectuée d’abord sur des échantillons inclus en paraffine couramment utilisés, suivis de coupes semi-minces et enfin de coupes ultra-minces sans instruments hautement développés et techniques sophistiquées. Les deux méthodes ont prouvé que seules la colocalisation d’une immunoréaction positive sur la structure d’intérêt (c’est-à-dire les virus) et l’identification de cette structure au niveau ultrastructural donnent une preuve indiscutable de la présence de virions.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/labs/pmc/articles/PMC8473209/

En résumé:

  • Le Dr Harold Hillman a posé la question ‘Qu’est-ce qu’une photo prise avec cet instrument nous apprend sur la structure de la cellule vivante ?’
  • Le TEM permet une résolution et un grossissement beaucoup plus élevés que le microscope optique, mais le tissu ne peut pas survivre à la basse pression, au bombardement d’électrons et au rayonnement X dans le microscope électronique
  • Ainsi, le tissu doit être recouvert d’un dépôt de sels d’osmium, de plomb ou de tungstène, qui n’est pas détruit par ces agents, et peut donc être examiné
  • Quand on regarde une illustration d’une micrographie électronique :
    1. Un animal a été tué
    2. ça refroidit
    3. Son tissu est excisé
    4. Le tissu est fixé (tué)
    5. Il est coloré avec un sel de métal lourd
    6. Il est déshydraté avec des concentrations croissantes d’alcool
    7. Il rétrécit
    8. L’alcool est extrait avec un solvant gras, l’oxyde de propylène
    9. Cette dernière est remplacée par une résine époxy
    10. Il durcit en quelques jours
    11. Des sections d’un dixième de millimètre d’épaisseur ou moins sont coupées
    12. Ils sont placés dans le microscope électronique, dont presque tout l’air est pompé
    13. Un faisceau d’électrons de 10 000 volts à 3 000 000 volts est dirigé vers lui
    14. Des électrons frappent un écran phosphorescent
    15. Les microscopistes électroniques sélectionnent le champ et le grossissement qui montrent les caractéristiques qu’ils souhaitent mettre en évidence
    16. L’image peut être améliorée
    17. Des photographies sont prises et certaines sont sélectionnées comme preuves
  • On peut immédiatement voir à quel point le tissu a voyagé de la vie à une illustration dans un livre
  • La plupart des nouvelles structures dans les cellules apparentes par microscopie électronique sont des artefacts
  • De nombreuses études ont rapporté la détection de supposées particules « virales » par microscopie électronique à transmission (MET) qui a été utilisée comme preuve suffisante de l’invasion « virale » du tissu rénal, mais les données concernant la détection de l’ARN « viral » ou d’autres méthodes précieuses pour la détection « virale » de des échantillons de rein manquaient
  • Dans une étude, les particules présentées dans les études susmentionnées présentent un diamètre de 50 à 150 nm et une couche dense aux électrons en forme de couronne, de sorte qu’elles peuvent ressembler à un «coronavirus» mais également à des vésicules enrobées omniprésentes, telles que des vésicules recouvertes de clathrine vésicules, ou vésicules recouvertes de COPI ou de COPII
  • De plus, des amas de particules « virales » à l’intérieur de la vacuole pourraient ressembler à des corps multivésiculaires (MVB), qui sont des structures régulières de la voie endocytaire.
  • Dans une étude de 4 patients confirmés avec le «SRAS-COV-2», l’ARN «viral» a été confirmé dans tous les échantillons de poumon, mais était négatif dans tous les échantillons de rein
  • Cependant, l’examen ultrastructural a révélé des structures vésiculaires intracellulaires de taille et de morphologie similaires dans les poumons avec un ARN “viral” prouvé et dans les reins sans ARN “viral”.
  • Dans des échantillons pulmonaires avec de l’ARN “viral” prouvé, les auteurs ont observé de nombreuses structures qui pourraient être soit des particules “virales” avec une couronne typique, soit des vésicules recouvertes d’un revêtement protéique dense aux électrons.
  • De plus, dans les mêmes échantillons pulmonaires « SARS-CoV-2-positifs », ils ont trouvé des vacuoles qui pourraient être soit des amas de particules « virales » liés à la membrane, soit des MVB avec des vésicules intraluminales à l’intérieur
  • D’autre part, examen ultrastructural des échantillons pulmonaires de 2 patients sans “SARS-CoV-2” (1 échantillon d’autopsie de poumon avec RT-PCR négatif pour l’ARN “viral” et 1 échantillon de biopsie de poumon avant l’ère “COVID” ) a révélé les mêmes structures, ressemblant à des particules « virales », des vésicules enrobées ou des MVB, comme dans un échantillon avec un « SARS-CoV-2 » positif
  • L’analyse TEM d’échantillons rénaux post-mortem de patients atteints de « COVID-19 » a révélé de nombreuses vésicules individuelles et groupes de vésicules dans différents types de cellules rénales, malgré une RT-PCR négative pour l’ARN du « SRAS-CoV-2 »
  • Ils ont en outre effectué une analyse semi-quantitative de ces structures intracellulaires dans différents types de cellules rénales à partir de 20 biopsies rénales de donneurs préimplantatoires, avant et pendant l’épidémie de « SRAS-CoV-2 », avec RT-PCR négative pour l’ARN du « SRAS-CoV-2 » démontrer que ces structures cellulaires sont nombreuses et omniprésentes dans divers types de cellules
  • De plus en plus de preuves indiquent que les vésicules enrobées et les MVB peuvent imiter les particules « virales »
  • on sait que le bourgeonnement de « virus » enveloppés (auquel appartient le « SRAS-CoV-2 ») à partir de la membrane plasmique, ou de la membrane limitante de l’endosome, ressemble à la formation de vésicules intraluminales à l’intérieur des MVB
  • De plus, les vésicules enrobées peuvent également ressembler légèrement à des particules « virales »
  • Les auteurs concluent que bien que la TEM puisse servir de méthode de diagnostic utile pour la détection d’une infection « virale », la prudence s’impose lorsque la confirmation de l’invasion « virale » ne repose que sur la TEM.
  • Des méthodes convaincantes supplémentaires , y compris la microscopie immunoélectronique, l’immunohistochimie et l’analyse du matériel génétique «viral», sont nécessaires pour une preuve indiscutable de l’invasion «virale» dans les organes
  • Il y a de plus en plus de preuves que l’identification des « virions du SRAS-CoV-2 » par microscopie électronique à transmission pourrait être trompeuse en raison de la morphologie similaire des « virions » et des structures cellulaires omniprésentes
  • Selon les auteurs, la microscopie immunoélectronique est la méthode la plus fiable pour distinguer les particules « virales » intracellulaires des structures cellulaires normales de morphologie et de taille similaires aux « virions ».
  • Peu de chercheurs ont attiré l’attention sur la possible mauvaise interprétation des découvertes TEM du “SRAS-COV-2” en raison de la similitude de structure et de taille entre les “virions” et les structures cellulaires normales
  • Dans une étude précédente, les auteurs déclarent avoir montré des structures cellulaires ressemblant à des « virions du SRAS-CoV-2 » dans des échantillons pulmonaires et rénaux de patients positifs et négatifs au « SRAS-CoV-2 » sur la base de leurs résultats de RT-PCR pour le « SRAS- ARN CoV-2″
  • Les méthodes existantes utilisées pour la détection « virale » dans les échantillons de tissus ont des limites connues
  • L’immunohistochimie peut être faussement positive ou négative pour plusieurs raisons dans la phase pré-analytique ou analytique
  • L’analyse TEM conventionnelle dépend fortement de la préservation des tissus, ce qui pourrait déformer la structure des “virus” si elle n’est pas effectuée de manière optimale
  • Un inconvénient supplémentaire de l’analyse TEM est que l’échantillon peut manquer la zone contenant des “virus”
  • Les auteurs ont réalisé une variante d’ immunohistochimie corrélative et d’immunomarquage des protéines “SARS-CoV-2” pour une preuve indiscutable de la présence de “virions SARS-CoV-2” dans le tissu nasopharyngé de patients avec une RT-PCR positive pour “SARS-CoV -2” ARN ( notez qu’ils n’ont mentionné aucun contrôle utilisant du tissu NP de patients négatifs pour le “SRAS-COV-2” )
  • Ils ont prétendu montrer qu’une immunoréaction spécifique et fiable dépend de manière cruciale du protocole d’immunomarquage, des premières étapes de la préparation de l’échantillon de tissu au choix de l’anticorps.
  • J’ai inclus le plan de chaque processus auquel les échantillons sont soumis afin que vous puissiez voir à combien de substances ils sont soumis et combien d’altérations ils subissent
  • Le processus d’immunohistochimie :
    1. Des morceaux de tissu nasopharyngé ont été fixés dans du paraformaldéhyde à 4% pendant 24 h, déshydratés dans de l’éthanol et inclus dans de la paraffine
    2. L’échantillon de tissu pour l’immunohistochimie a été obtenu en poinçonnant le bloc de paraffine avec un poinçon de tissu manuel
    3. Les blocs de paraffine poinçonnés ont ensuite été déparaffinés et réhydratés avec de l’éthanol
    4. La récupération de l’antigène a été effectuée avec un chauffage par micro-ondes dans un tampon de citrate de sodium 10 mM, pH 6,0 pendant 20 min
    5. Les peroxydases endogènes ont été bloquées par du peroxyde d’hydrogène à 3 % pendant 15 min après incubation dans des anticorps primaires de lapin contre la protéine de nucléocapside « SARS-CoV-2 » pendant 2 h à température ambiante
    6. Après lavage avec un tampon de réaction, un kit de détection UltraView Universal DAB a été utilisé avec le protocole suivant :
      • Enzyme HRP conjuguée à des anticorps secondaires de chèvre anti-lapin pendant 20 min
      • Tampon de réaction deux fois pendant 5 min
      • Un mélange de 3,3′-diaminobenzidine (DAB) chromogène et H2O2 pendant 20 min
      • Lavé avec un tampon de réaction et de l’eau distillée pendant 5 min
  • Le processus de microscope électronique à transmission :
    1. Après l’IHC, les échantillons de tissus ont été transférés dans du tampon phosphate de Millonig 0,1 M pendant la nuit
    2. Ils ont d’abord été post-fixés dans 1% OsO4 pendant 30 min
    3. Ils ont été déshydratés dans des concentrations graduées d’éthanol et d’oxyde de propylène 1-2-oxyde de propylène pendant 10 min dans chaque solution
    4. Les morceaux de tissus ont ensuite été incubés dans un mélange (1:1) d’oxyde de 1-2-propylène et de résine Epon 812 pendant 20 min.
    5. Ils ont été intégrés dans 100% Epon
    6. Puis polymérisé à 60 ◦C pendant 24 h
    7. Le lendemain, des coupes semi-fines de 1 µm ont été coupées avec un ultramicrotome Leica EM UC6 et colorées avec la solution de coloration Azure II pour trouver des cellules “SARS-CoV-2-positives” comme région d’intérêt, afin de sélectionner cette région pour une coupe ultra-fine
    8. Des coupes ultrafines de 60 nm ont été coupées et visualisées au microscope électronique à transmission
  • Le processus de marquage Immunogold sur coupes ultrafines ( coupes Epon ) :
    1. De petits échantillons (2 mm3) de tissu nasopharyngé ont été fixés dans un mélange de 4% de paraformaldéhyde et 2% de glutaraldéhyde dans du tampon cacodylate 0,2 M (pH 7,3) pendant 3 h à 4 ◦C
    2. Un rinçage nocturne dans du saccharose 0,33 M dans un tampon cacodylate 0,2 M a été suivi d’une post-fixation avec 1 % d’OsO4 pendant 1 h
    3. Après déshydratation dans une série d’éthanol, des échantillons de tissus ont été inclus dans de la résine Epon 812 et coupés en sections ultrafines (60 nm d’épaisseur), qui ont été recueillies sur des grilles de nickel
    4. Le traitement de démasquage antigénique a été réalisé par incubation de quelques grilles en chambre humide sur une grosse goutte d’une solution aqueuse saturée de métapériodate de sodium pendant 1 h à température ambiante
    5. Les grilles sont ensuite lavées à l’eau distillée
    6. Le marquage non spécifique a été bloqué par un tampon de blocage (5 % de sérum de veau fœtal dans 0,1 % de BSA dans du PBS (tampon de lavage)) pendant 30 min à température ambiante
    7. Des anticorps primaires contre la protéine de nucléocapside «SARS-CoV-2» ou la glycoprotéine de pointe «SARS-CoV-2» diluée au 1:100 ont été appliqués et incubés pendant la nuit à 4 ◦C
    8. Après lavage dans un tampon de lavage, des anticorps secondaires de chèvre anti-lapin avec 18 nm d’or (Au) dilué au 1:40 dans du tampon de blocage ont été appliqués pendant 90 min
    9. Dans tous les cas, des contrôles négatifs ont également été effectués, dans lesquels les anticorps primaires ont été remplacés par du PBS
    10. Les coupes ont été contre-colorées avec de l’acétate d’uranyle et du citrate de plomb
  • Le processus de marquage Immunogold sur coupes ultrafines ( coupes Lowicryl ) :
    1. De petits cubes (1 mm 3) de tissu nasopharyngé ont été transférés dans du paraformaldéhyde à 2% plus du glutaraldéhyde à 0,05% dans du PBS pendant 1 h à température ambiante
    2. Les échantillons ont été déshydratés en abaissant progressivement la température
    3. Enrobé dans de la résine Lowicryl HM20 dans un appareil Leica AFS selon le protocole suivant :
      • 30% d’éthanol pendant 30 min à 0 ◦C
      • 55% éthanol pendant 30 min à −15 ◦C
      • 70% éthanol pendant 30 min à −30 ◦C
      • 100% éthanol pendant 1 h à −50 ◦C
      • 75 % éthanol/25 % HM20 pendant 1 h à −50 ◦C
      • 50 % éthanol/50 % HM20 pendant 1 h à −50 ◦C
      • 25 % éthanol/75 % HM20 pendant 1 h à −50 ◦C
      • 100 % HM20 pendant 1 h et 100 % HM20 pendant la nuit à -50 ◦C
    4. HM20 a été polymérisé pendant 48 h à -50 ◦C puis pendant 24 h à -20 ◦C sous lumière UV
    5. Des coupes ultrafines (60 nm d’épaisseur) ont été coupées et collectées sur des grilles de nickel
    6. Les sections ont été lavées dans un tampon de lavage (0,1 % d’azide de Na, 0,8 % de BSA et 0,1 % de gélatine IGSS dans du PBS)
    7. Bloqué dans un tampon de blocage (5 % de sérum de veau fœtal dans 0,1 % de BSA dans du PBS (tampon de lavage)) pendant 30 min à température ambiante
    8. Incubé pendant une nuit à 4 ◦C avec des anticorps primaires contre la protéine de nucléocapside «SARS-CoV-2» diluée à 1:50 ou la glycoprotéine de pointe «SARS-CoV-2» S1 diluée à 1:100.
    9. Après lavage dans un tampon de lavage, des anticorps secondaires de chèvre anti-lapin avec 18 nm d’or (Au) dilué au 1:40 dans du tampon de blocage ont été appliqués pendant 90 min
    10. Les coupes ont été contre-colorées avec de l’acétate d’uranyle et du citrate de plomb
  • Les auteurs déclarent que grâce au marquage immunogold, ils ont confirmé la présence de «virions SARS-CoV-2» dans des échantillons de tissus nasopharyngés humains
  • Cependant, les résultats de cette méthode dépendaient grandement du type de coupes ultrafines et des anticorps primaires utilisés dans le protocole d’immunomarquage
  • La réaction d’Immunogold sur des coupes Epon ultrafines avec des anticorps primaires contre la protéine de nucléocapside “SARS-CoV-2” était omniprésente et donc non spécifique
  • Sur les coupes ultrafines d’Epon avec des anticorps primaires contre la glycoprotéine de pointe «SARS-CoV-2» S1, elle était rare et non spécifique
  • Après une procédure de démasquage de l’antigène sur des coupes ultrafines d’Epon avec des anticorps primaires contre la glycoprotéine S1 de pointe “SARS-CoV-2”, le marquage immunogold était plus “spécifique” mais faible
  • Ce n’est que lorsqu’ils ont effectué un marquage immunogold sur des coupes Lowicryl ultrafines avec des anticorps primaires contre la glycoprotéine de pointe «SARS-CoV-2» S1 que leur réaction a été «spécifique» et intense
  • L’analyse du matériel génétique « viral » du tissu nasopharyngé des patients n’est pas en soi une preuve suffisante de l’infection active par le « SRAS-CoV-2 » dans les tissus corporels, mais un test RT-PCR positif est une condition préalable à une analyse plus approfondie du « SRAS-CoV-2 ». 2 présence du virus dans un tissu particulier
  • L’analyse TEM en soi n’est pas suffisante pour une preuve sans équivoque des “virions du SRAS-CoV-2” dans le tissu d’intérêt en raison de la structure et de la taille similaires de ces “virions” et des structures cellulaires omniprésentes
  • Comme ces étapes ne constituent pas à elles seules une preuve valable, les auteurs ont effectué une microscopie corrélative dans laquelle ils ont combiné les avantages de l’IHC et de la microscopie électronique pour analyser le même échantillon .
  • L’immunohistochimie est une méthode complémentaire courante en pathologie à des fins de diagnostic, mais toutes les étapes de cette technique doivent être optimisées
  • Les antigènes sont connus pour être vulnérables à plusieurs étapes de la procédure immunohistochimique et également lors de la préparation des échantillons pour TEM
  • De leur point de vue, la microscopie immunoélectronique est la méthode la plus fiable pour distinguer les particules « virales » intracellulaires des structures cellulaires normales de morphologie et de taille similaires aux « virions ».
  • Cependant, les auteurs admettent qu’une réaction IHC au niveau de la microscopie optique en soi pourrait être trompeuse en raison de divers facteurs dans la phase pré-analytique et d’une mauvaise interprétation de la coloration non spécifique
  • De plus, le faible grossissement et la faible résolution de l’IHC ne permettent pas aux pathologistes de voir des “virions” ou d’être convaincus qu’une réaction IHC colocalise avec des “virions”
  • De même, l’analyse TEM conventionnelle en soi n’est pas non plus suffisante pour une preuve incontestable des “virions” présents
  • À savoir, malgré la possibilité de voir les structures (“virions”) avec TEM en raison de sa haute résolution, elles peuvent être mal interprétées
  • Seule la combinaison de la localisation d’une immunoréaction positive sur la structure d’intérêt (c’est-à-dire des « virus ») et de l’identification simultanée de cette structure au niveau ultrastructural apporte une preuve indiscutable de la présence de « virions »
  • En d’autres termes, les auteurs estiment que la combinaison de deux techniques qu’ils admettent par elles-mêmes ne peut être considérée comme une preuve est en quelque sorte considérée comme une preuve
  • Afin d’éviter les pièges de l’étiquetage immunogold, des milieux de fixation et d’enrobage appropriés, qui peuvent restreindre à la fois l’accès aux anticorps et la qualité des anticorps, sont cruciaux
  • Dans leur étude, les résultats du marquage immunogold des “virions SARS-CoV-2” dépendaient fortement de la sélection de l’anticorps primaire et de la résine
  • Ce n’est que sur des coupes Lowicryl et avec un anticorps approprié qu’ils ont pu obtenir une coloration “spécifique” et une ultrastructure satisfaisante
  • Les auteurs concluent que la microscopie immunoélectronique, si elle est effectuée correctement, est la méthode la plus fiable pour distinguer les particules « virales » intracellulaires des structures cellulaires normales de morphologie et de taille similaires à celles des « virions ».

Quelles sont exactement les particules qui ont été sélectionnées parmi une mer de milliards de sosies pour être utilisées comme représentation du « SRAS-COV-2 » ? S’agit-il de vésicules enrobées, de corps multivésiculaires, d’exosomes, de vésicules enrobées de golgi et de costomère, de vésicules sécrétoires et/ou de vésicules enrobées de clathrine ? Sont-ils tous ou aucun des éléments ci-dessus ? Sont-ils simplement des artefacts créés par les multiples processus de modification structurelle auxquels les échantillons sont soumis afin d’obtenir les images, comme l’a montré le Dr Harold Hillman avec ses recherches sous-estimées ?

Quoi qu’il en soit, il est absolument impossible d’affirmer que ces particules sont du « SARS-COV-2 » ou tout autre « virus » car elles n’ont jamais été correctement purifiées ni isolées directement à partir d’échantillons d’humains malades. C’est la raison même pour laquelle les chercheurs ne peuvent pas distinguer les particules qu’ils croient être «SARS-COV-2» de l’une des autres particules «non virales» normales identiques ou presque identiques dans l’échantillon. Ils n’ont jamais eu les particules exactes qu’ils prétendent être “SARS-COV-2” séparées et libérées de tout le reste (c’est-à-dire isolées). L’isolement absolu est le seul moyen pour tout chercheur d’être entièrement certain que les particules avec lesquelles il travaille sont celles qu’il croit être la cause de la maladie. C’est le seul moyen de prouver la pathogénicité en adhérant à la méthode scientifique. C’est la seule façon de caractériser biochimiquement et moléculairement les particules. C’est la seule façon dont ils pourraient tenter de montrer une spécificité avec certains anticorps. C’est la seule façon pour que les images TEM aient une valeur quelconque comme preuve de particules « virales ».

Sans purifier et isoler les particules que l’on croit être « SRAS-COV-2 », nous obtenons des résultats confus, faux et erronés. Nous obtenons un groupe de chercheurs affirmant que les particules « corona » sont un nouveau « virus », tandis qu’un autre groupe de chercheurs affirme qu’il s’agit de corps multivésiculaires et/ou d’autres particules subcellulaires normales. Nous obtenons des résultats d’anticorps non spécifiques revendiqués comme spécifiques, mais la spécificité ne peut pas être démontrée et reproduite par des chercheurs indépendants. Nous obtenons des particules «SARS-COV-2» trouvées dans des échantillons avec de l’ARN «viral» confirmé ainsi que dans ceux sans aucun ARN «viral». Plus important encore, nous obtenons des particules « SRAS-COV-2 » trouvées dans les échantillons de patients négatifs à la PCR prélevés avant même que le « virus » n’existe.

En mettant tout cela ensemble, il est tout à fait clair que les images des particules prétendument « SRAS-COV-2 » sont aussi dénuées de sens que les résultats du matériel génétique « viral » obtenu par PCR. Ils sont aussi dénués de sens que les anticorps «spécifiques» qui se lient régulièrement à du matériel non cible. Ils sont aussi dénués de sens que les génomes assemblés générés par ordinateur provenant de sources non purifiées. De toutes les manières mesurables possibles, les résultats indirects censés identifier des entités “virales” dont l’existence n’a jamais été démontrée à l’état purifié et isolé sont totalement dénués de sens. Ces images améliorées de particules non spécifiques n’ont de valeur que pour ceux qui vous ont manipulé par la peur et la propagande. Ne les laissez pas détenir plus de pouvoir sur vous à l’avenir.

Lorsqu’ils peuvent trouver exactement les mêmes particules « virales » chez ceux qui ne sont pas porteurs du « virus », il est temps pour la virologie d’admettre l’évidence :

Par Mike Stone

 

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